蛋白质的分离纯化有多类方法，如沉淀法（特别常用盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法）、膜分离法（超滤法、透析法）、色谱法、离心分离法等。每类方法有其自己的特点和适用范围。如粗提常用沉淀法，精提就不会用沉淀法。这些方法中，应用最广的是色谱法。

   色谱法，在生化和医药行业叫层析。但中国化学会、中科院相关部门及有关期刊都规定要叫色谱。在国家有关色谱名词术语的国家标准中“chromatography”一词翻译成“色谱”。故在此我们将柱分离叫色谱。柱内的分离介质一般也叫填料、固定相。

   在蛋白质色谱纯化中最重要的是分离介质和色谱条件的选择。有些从事分离工作的人，拿到样品后常不知道怎么办。其实这两者的选择只要根据分离对象和每种色谱的分离机理来考虑，就可以自行设计分离方案。蛋白质分离介质的选择应从蛋白质分子结构入手考虑。与一般小分子的天然产物和合成化合物的分离纯化工作比起来，蛋白质的分离有许多特殊性。

   1.蛋白质分子的结构决定了其分离工作的方法选择。

   蛋白质分子量大，都在6KD以上，是由多个氨基酸按一定序列通过肽键组合成肽链，再由一个或多个肽链通过共价键和非共价键组合成有复杂三级、四级结构的蛋白质分子。蛋白质还可能与糖、脂及核酸结合得到结合蛋白，不同的结合蛋白在性质上会有差异。蛋白质的外形为球状和纤维状，其大小因其分子量不同差异很大。故可以用排阻色谱、超滤和膜法分离大小不同的蛋白质。

   蛋白质与氨基酸一样，会两性离解，在不同的pH下形成正离子或负离子，蛋白质也有等电点。在相同的pH下，不同的蛋白质表面带电情况不一样，故可以用离子交换色谱分离蛋白质。

   蛋白质的氨基酸残基会有一些苯基、烷基等疏水性基团，这些疏水侧链在水相中会尽可能避开水相而藏于蛋白质分子内部，形成蛋白质分子外部亲水性基团多，疏水性基团多在蛋白质裂隙内部的情况，在不同条件下蛋白质裂隙会有不同的伸展而暴露出内部的疏水基团。在同一个介质中，不同蛋白质表面的疏水性不同，可以用疏水相互作用色谱和反相色谱分离。

   生物大分子有一个特性，某些分子或基团对它们有特异性很强的吸附作用。这种作用只针对一种或一类目标物质。如抗体特异性吸附抗原，苯甲脒对含丝氨酸的蛋白质有吸附作用。这就是亲和色谱的应用原理, 一般的小分子是不会有这种特异性吸附作用的。

   2.要特别注意保持样品的生物活性。

   蛋白质有复杂的三级、四级结构，热、光和化学品会导致其理化性质改变和生理活性丧失，这叫失活。失活有可逆和不可逆两种。不可逆失活的蛋白质常是固体，不溶于水和溶剂，不再具有蛋白质原有的生理性质。可逆失活的蛋白质可用不同的复性方法恢复其原有的生理活性。

   蛋白质在选择和评价分离纯化的方法、介质和色谱条件时，不仅要注意样品的质量回收率，还特别要重视活性回收率。要保持样品的生物活性，在分离方法、填料、色谱条件和操作工艺上要注意。

   在排阻、离子交换、疏水和反相、亲和四类色谱中，反相色谱一般容易使样品失活，常用于定性、定量分析和氨基酸序列分析，不太用于制备；其他的色谱方法，只要条件选择合适，都可以得到高的活性回收率。

   3.使用的色谱介质要注意其合适的分子量适用范围。

   一般的介质都是多孔的，多孔介质的比表面有90%~95% 是在孔内。分离时充分利用孔内表面，柱容量才能大。所以要根据样品分子量选择具有合适的孔的介质。在排阻色谱中孔的大小用排阻极限表示；其他色谱用分子量适用范围表示，实际是其基质的排阻极限。

   常用的蛋白质分离介质是琼脂糖和葡聚糖系列。琼脂糖的分子量适用范围取决于制备时琼脂糖的浓度，大家熟悉的4B，糖的浓度是4%，适用6×10 4~2×10 7分子量；6B，糖的浓度是6%，适用1×10 4~4×10 6分子量。葡聚糖系列的分离范围要看产品说明书，从几千到上千万不等。

   常用的硅胶系列孔径有用于小分子的6~12nm ；有用于一定分子量蛋白质的30 、 50、100nm。

   4. 生物大分子有不同于小分子的色谱特性。

   包括蛋白质在内的生物大分子有一些特别的色谱性质。

   在梯度洗脱的色谱，如反相色谱、疏水色谱、离子交换中，强洗脱剂的浓度对保留值（容量因子）作图有明显的突跃。而有机小分子没有此突跃。在蛋白质分离的许多问题可由此得到解释。

   5.紫外检测器检测波长固定在280nm和220nm 。

   280nm是检测蛋白质中的苯基，220nm是检测肽键。蛋白质检测实际常在选用280nm 检测波长。

   蛋白质分离介质选择要同时考虑两方面，一是配基，也就是选择色谱模式；二是选择基质，包括基质的种类和排阻极限的选择。

   根据目标产品与杂质的性质差异选择介质是介质选择的主要依据。选择了介质也就是选择了分离模式。

   目标产品与杂质在分子大小、等电点pI、不失活或可逆失活条件下的疏水性、与亲和配基的作用四种性质上的差异是介质选择的主要依据之一。产品与杂质某方面的性质有大的差异，就可用来做为分离方法选择的依据。目标产品与杂质分子大小差异大可用凝胶色谱分离；等电点pI差异大可用离子交换色谱分离；不失活或可逆失活条件下的疏水性差异大可用疏水色谱分离；与某个亲和配基有特异作用的可用亲和色谱分离。

   在凝胶色谱、离子交换、疏水和反相、亲和类色谱中，反相色谱一般容易使样品失活，常用于定性、定量分析和氨基酸序列分析，不太用于制备；其他的色谱方法，只要条件选择合适，都可以得到高的活性回收率，可以用于制备分离。

   基质主要有3大类：聚多糖，如交联琼脂糖、葡聚糖基质；硅胶和多孔玻璃；有机聚合物（聚苯乙烯等）。

   由于目标产品限定在蛋白质，分子量比较大，用于小分子的小孔填料肯定不能用。因为，多孔填料的总的表面积，有90~95%是在孔内，球型填料的球面上的面积只占有5~10%。小孔填料的柱容量太小。

   大孔硅胶和多孔玻璃，与蛋白质生物相容性差，大孔硅胶价格贵，表面活性基团少，制备的填料会残留酸性的硅羟基，造成非特异性吸附。大孔有机聚合物疏水性强，与蛋白质生物相容性太差，不作亲水性处理无法用于蛋白质分离。

   交联琼脂糖、葡聚糖基质是最适合用于蛋白质分离的基质材料，这两类材料生物相容性好，无非特异性吸附，表面有大量羟基，可用于连接配基，制得各种填料。

   琼脂糖微球及其交联后的产品一般叫4B、CL4B、4FF、6B、CL6B、6FF，这些产品再键合上不同基团得到离子交换、疏水、亲和色谱填料。4B、CL4B、4FF制备时的糖浓度为4%，排阻极限为6万~2000万。6B、CL6B、6FF制备时的糖浓度为6% ，排阻极限为1万 ~400万。4B、6B耐压低；CL4B、CL6B耐压稍高一点，仍很低；4FF、6FF耐压较高，使用压力可到0.15或0.3MPa。

   葡聚糖是线形结构，用环氧氯丙烷交联成球。因糖浓度和交联度不同，得到不同排阻极限的微球。葡聚糖微球排阻极限范围小些，在使用时不同条件下柱体积会有较大的变化，已逐渐较少用于离子交换、疏水、亲和色谱，较多用于凝胶色谱。