支原体培养基质控菌株菌种代次与生长曲线研究
朱真，万建青*，杨挺英，康凯
（中国兽医药品监察所，北京 100081）
[摘 要] 为探究支原体液体培养基和固体培养基质控菌猪鼻支原体生长规律，以活菌浓度，菌液pH值为指标，比较不同代次与不同传代方式猪鼻支原体生长情况。结果显示：①3%与10%浓度传代，0h~48h内，活菌浓度持续上升，菌液pH值持续下降，3%浓度传代的支原体生长较均匀，更利于菌种生长；②1~5代支原体活菌浓度无显著差异；③通过0.3mL菌液加9.7mL培养基传代，20组菌液平均浓度为（24.4±5.7）×108CFU/mL，通过0.9mL菌液加29.1mL培养基传代，菌液平均浓度为（7.2±2.1）×108CFU/mL，两种浓度差异极显著。本次试验为支原体液体和固体培养基的质控工作标准化提供了理论依据。
[关键词] 猪鼻支原体；培养基质控；菌种代次；传代
Study on the Generation and Growth Curve of Mycoplasma Culture Medium Quality Control Strains
ZHU Zhen，WAN Jian-qing*， YANG Ting-ying， KANG Kai
（China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081）
Abstract To research the growth law of mycoplasma hyorhinis， mycoplasma liquid and solid medium quality control strains，the text compared mycoplasma hyorhinis growth conditions under different generations and different passage methods with the index of pH value and living strains concentration. The results are followed: ①Comparing passage concentration 3% and 10%, mycoplasma strains grew increasing and pH value continued to decline under two different concentration，but passage concentration 3% was more conducive to mycoplasma hyorhinis growth steady. ②There was no significant difference in the living strains concentration between 1~5 generations of mycoplasma. ③By mixing 0.3mL bacteria suspension and 9.7mL medium, average bacteria concentration of 20 groups was (24.4±5.7)×108CFU/mL, by mixing 0.9ml bacteria suspension and 29.1ml medium, while the average value was (7.2±2.1)×108CFU/mL, two kinds of concentrations had a very significant difference. The text provided theory basis for the medium standardization work.
Key words：mycoplasma hyorhinis；medium quality control；strains generation；passage.
支原体，又译作霉形体，是目前已知的最小自我复制原核生物，无细胞壁，胞体柔软，具多形性。由于基因组小，合成能力弱，固营养要求高，支原体污染是细胞培养过程中常见和棘手的污染源，培养法是支原体检验的常用方法[1,2,3]。《中国兽药典》二〇一〇版三部中对相关支原体培养基的质控作了规定，猪鼻支原体（CVCC361）是支原体液体培养基和支原体固体培养基的质控菌株[4]，本试验主要研究猪鼻支原体的生长特性以及菌液活菌浓度与pH变化的关系，通过活菌计数和菌液pH值测定，确定菌液接种培养基的最适浓度、收菌时间以及适宜传代代次，旨在为支原体液体培养基和支原体固体培养基的质控工作的标准化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 猪鼻支原体（CVCC361），由中国兽医药品监察所提供。
1.1.2 培养基 支原体液体培养基、支原体固体培养基，均由北京中海生物科技有限公司提供。
1.1.3 仪器 生物安全柜，NUAIR公司；CO2培养箱，SANYO公司；37℃培养箱，SANYO公司；pH计，METTLER TOLEDO公司；涡旋震荡器，北京金紫光科技发展有限公司；冰箱，海尔公司。
1.2 方法
1.2.1 不同接种浓度和收获时间差异比较
1.2.1.1 菌液制备 将猪鼻支原体冻干菌株启开，用支原体液体培养基恢复原体积，再以10%比例接种至支原体液体培养基中，37℃培养24h后，分别按3%（将0.9ml菌液加至29.1mL支原体液体培养基中）和10%（将3mL菌液加至27mL支原体液体培养基中）两种比例进行连续传代，选择3代菌作为工作菌液。
1.2.1.2 活菌计数及pH值测定 以传代后放入培养箱培养的时刻作为该代次菌株生命的零点，分别选择3%浓度接种菌液的0h、16h、24h、40h、48h以及10%浓度接种菌液的0h、6h、24h、30h、48h这几个时间点，吸取菌液0.2ml至1.8mL支原体液体培养基中，以这种方式，10倍系列稀释至10-6，选择该稀释度菌液，吸取0.1ml滴至支原体固体培养基平皿表面，进行活菌计数，同时对相应时间点的菌液进行pH值测定，每种比例分别选取3个样本。
1.2.1.3 生长曲线的绘制 取各时间点的活菌计数结果的平均值，以时间为横轴，分别以活菌浓度和pH值变化值为纵轴，绘制3%和10%传代比例下的猪鼻支原体生长曲线和pH值变化曲线。
1.2.2 不同菌种代次差异比较
1.2.2.1 菌液制备 将猪鼻支原体冻干菌株启开，用支原体液体培养基恢复原体积，10%比例接种至支原体液体培养基中，37℃培养24h后，再按3%比例，将0.3mL菌液加至9.7mL支原体液体培养基中，以这种方式，连续传至5代，分别选择1~5代菌作为工作菌液。
1.2.2.2 活菌计数 分别选择1~5代菌菌液，各代次选取4个样本，用“1.2.2”中所提及的方法，进行活菌计数。
1.2.3 不同传代体积差异比较
1.2.3.1 菌液制备与活菌计数 将猪鼻支原体冻干菌株启开，用1mL支原体液体培养基恢复原体积，10%比例接种至支原体液体培养基中，37℃培养24h后，再按3%比例，分别选择两种不同培养体积传代，一种方式是将0.3mL菌液加至9.7mL支原体液体培养基中，另一种则是0.9mL菌液加至29.1mL培养基，37℃培养24h后，再以各自的方式传至下一代，直至5代，随机选择两种方式传代的2~5代菌各20个样本，用“1.2.2”中所提及的方法进行活菌计数，并用t检验（双样本异方差检验）进行比较。
2 结果
2.1不同接种浓度和收获时间差异比较
2.1.1 不同接种浓度活菌浓度和pH值的比较 两种浓度接种的猪鼻支原体各时间点的活菌浓度和pH值如表3、表4所示。从表3可以看出，3%浓度接种的猪鼻支原体0h~48h活菌浓度持续上升，到48h达到峰值13.1×108CFU/mL，菌液pH值则持续下降，在40h~48h之间某时刻降至7.0以下。从表4可以看出，10%浓度接种的猪鼻支原体0h~48h活菌浓度持续上升，到48h达到峰值14.0×108CFU/mL，菌液pH值则持续下降，在30h~48h之间某时刻降至7.0以下。
朱真，万建青*，杨挺英，康凯
（中国兽医药品监察所，北京 100081）
[摘 要] 为探究支原体液体培养基和固体培养基质控菌猪鼻支原体生长规律，以活菌浓度，菌液pH值为指标，比较不同代次与不同传代方式猪鼻支原体生长情况。结果显示：①3%与10%浓度传代，0h~48h内，活菌浓度持续上升，菌液pH值持续下降，3%浓度传代的支原体生长较均匀，更利于菌种生长；②1~5代支原体活菌浓度无显著差异；③通过0.3mL菌液加9.7mL培养基传代，20组菌液平均浓度为（24.4±5.7）×108CFU/mL，通过0.9mL菌液加29.1mL培养基传代，菌液平均浓度为（7.2±2.1）×108CFU/mL，两种浓度差异极显著。本次试验为支原体液体和固体培养基的质控工作标准化提供了理论依据。
[关键词] 猪鼻支原体；培养基质控；菌种代次；传代
Study on the Generation and Growth Curve of Mycoplasma Culture Medium Quality Control Strains
ZHU Zhen，WAN Jian-qing*， YANG Ting-ying， KANG Kai
（China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081）
Abstract To research the growth law of mycoplasma hyorhinis， mycoplasma liquid and solid medium quality control strains，the text compared mycoplasma hyorhinis growth conditions under different generations and different passage methods with the index of pH value and living strains concentration. The results are followed: ①Comparing passage concentration 3% and 10%, mycoplasma strains grew increasing and pH value continued to decline under two different concentration，but passage concentration 3% was more conducive to mycoplasma hyorhinis growth steady. ②There was no significant difference in the living strains concentration between 1~5 generations of mycoplasma. ③By mixing 0.3mL bacteria suspension and 9.7mL medium, average bacteria concentration of 20 groups was (24.4±5.7)×108CFU/mL, by mixing 0.9ml bacteria suspension and 29.1ml medium, while the average value was (7.2±2.1)×108CFU/mL, two kinds of concentrations had a very significant difference. The text provided theory basis for the medium standardization work.
Key words：mycoplasma hyorhinis；medium quality control；strains generation；passage.
支原体，又译作霉形体，是目前已知的最小自我复制原核生物，无细胞壁，胞体柔软，具多形性。由于基因组小，合成能力弱，固营养要求高，支原体污染是细胞培养过程中常见和棘手的污染源，培养法是支原体检验的常用方法[1,2,3]。《中国兽药典》二〇一〇版三部中对相关支原体培养基的质控作了规定，猪鼻支原体（CVCC361）是支原体液体培养基和支原体固体培养基的质控菌株[4]，本试验主要研究猪鼻支原体的生长特性以及菌液活菌浓度与pH变化的关系，通过活菌计数和菌液pH值测定，确定菌液接种培养基的最适浓度、收菌时间以及适宜传代代次，旨在为支原体液体培养基和支原体固体培养基的质控工作的标准化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 猪鼻支原体（CVCC361），由中国兽医药品监察所提供。
1.1.2 培养基 支原体液体培养基、支原体固体培养基，均由北京中海生物科技有限公司提供。
1.1.3 仪器 生物安全柜，NUAIR公司；CO2培养箱，SANYO公司；37℃培养箱，SANYO公司；pH计，METTLER TOLEDO公司；涡旋震荡器，北京金紫光科技发展有限公司；冰箱，海尔公司。
1.2 方法
1.2.1 不同接种浓度和收获时间差异比较
1.2.1.1 菌液制备 将猪鼻支原体冻干菌株启开，用支原体液体培养基恢复原体积，再以10%比例接种至支原体液体培养基中，37℃培养24h后，分别按3%（将0.9ml菌液加至29.1mL支原体液体培养基中）和10%（将3mL菌液加至27mL支原体液体培养基中）两种比例进行连续传代，选择3代菌作为工作菌液。
1.2.1.2 活菌计数及pH值测定 以传代后放入培养箱培养的时刻作为该代次菌株生命的零点，分别选择3%浓度接种菌液的0h、16h、24h、40h、48h以及10%浓度接种菌液的0h、6h、24h、30h、48h这几个时间点，吸取菌液0.2ml至1.8mL支原体液体培养基中，以这种方式，10倍系列稀释至10-6，选择该稀释度菌液，吸取0.1ml滴至支原体固体培养基平皿表面，进行活菌计数，同时对相应时间点的菌液进行pH值测定，每种比例分别选取3个样本。
1.2.1.3 生长曲线的绘制 取各时间点的活菌计数结果的平均值，以时间为横轴，分别以活菌浓度和pH值变化值为纵轴，绘制3%和10%传代比例下的猪鼻支原体生长曲线和pH值变化曲线。
1.2.2 不同菌种代次差异比较
1.2.2.1 菌液制备 将猪鼻支原体冻干菌株启开，用支原体液体培养基恢复原体积，10%比例接种至支原体液体培养基中，37℃培养24h后，再按3%比例，将0.3mL菌液加至9.7mL支原体液体培养基中，以这种方式，连续传至5代，分别选择1~5代菌作为工作菌液。
1.2.2.2 活菌计数 分别选择1~5代菌菌液，各代次选取4个样本，用“1.2.2”中所提及的方法，进行活菌计数。
1.2.3 不同传代体积差异比较
1.2.3.1 菌液制备与活菌计数 将猪鼻支原体冻干菌株启开，用1mL支原体液体培养基恢复原体积，10%比例接种至支原体液体培养基中，37℃培养24h后，再按3%比例，分别选择两种不同培养体积传代，一种方式是将0.3mL菌液加至9.7mL支原体液体培养基中，另一种则是0.9mL菌液加至29.1mL培养基，37℃培养24h后，再以各自的方式传至下一代，直至5代，随机选择两种方式传代的2~5代菌各20个样本，用“1.2.2”中所提及的方法进行活菌计数，并用t检验（双样本异方差检验）进行比较。
2 结果
2.1不同接种浓度和收获时间差异比较
2.1.1 不同接种浓度活菌浓度和pH值的比较 两种浓度接种的猪鼻支原体各时间点的活菌浓度和pH值如表3、表4所示。从表3可以看出，3%浓度接种的猪鼻支原体0h~48h活菌浓度持续上升，到48h达到峰值13.1×108CFU/mL，菌液pH值则持续下降，在40h~48h之间某时刻降至7.0以下。从表4可以看出，10%浓度接种的猪鼻支原体0h~48h活菌浓度持续上升，到48h达到峰值14.0×108CFU/mL，菌液pH值则持续下降，在30h~48h之间某时刻降至7.0以下。
表1 3%浓度接种猪鼻支原体各时刻生长情况
|
时间（h）
|
0
|
16
|
24
|
40
|
48
|
|
活菌浓度（108CFU/ml)
|
0.12
|
2.7
|
4.6
|
9.9
|
13.1
|
|
pH值
|
7.51
|
7.50
|
7.36
|
7.07
|
6.87
|
|
pH变化值
|
0
|
-0.01
|
-0.15
|
-0.44
|
-0.64
|
表2 10%浓度接种猪鼻支原体各时刻生长情况
|
时间（h）
|
0
|
6
|
24
|
30
|
48
|
|
活菌浓度（108CFU/ml)
|
0.45
|
0.57
|
6.8
|
11.3
|
14.0
|
|
pH值
|
7.54
|
7.55
|
7.29
|
7.12
|
6.63
|
|
pH变化值
|
0
|
0.01
|
-0.25
|
-0.42
|
-0.91
|
2.1.2 生长曲线 两种接种浓度猪鼻支原体生长曲线见图2、图3。从图2可以看出，以3%浓度接种，猪鼻支原体在0h~48h活菌浓度平稳上升，生长速率逐渐升高。以10%浓度接种，猪鼻支原体在0h~48h活菌浓度持续上升，0h~6h为迟缓期，6h~48h为对数期，其中24h~30h生长速率最快。从图3可以看出，0h~48h内，两种浓度接种菌液pH值变化范围和趋势大致相同，变化范围为6.63~7.55。3%浓度接种，0h~16h内，pH值下降平缓，16h~48h pH值下降速度较快。10%浓度接种，0h~6h内，pH值下降平缓，6h~48h pH值下降速度较快，且10%比3% pH值下降更快。
图1 不同接种比例猪鼻支原体生长曲线
图2不同接种比例猪鼻支原体pH值变化
2.2 1~5代菌活菌计数结果 见表1，图1。根据各处理重复数相等的方差分析方法[5]，对各代次间活菌浓度进行差异分析，结果见表3。由表3可知，F=1.67＜F0.05（4,15）=3.06，即1~5代猪鼻支原体各代次间活菌浓度无显著差异。
表3 1~5代菌活菌计数结果
|
代次
|
活菌浓度（108CFU/ml）
|
平均
|
|
|
样本1
|
样本2
|
样本3
|
样本4
|
|
|
1
|
33.6
|
27.9
|
34.5
|
15.0
|
27.8
|
|
2
|
12.7
|
16.0
|
19.0
|
23.0
|
17.7
|
|
3
|
20.6
|
24.2
|
21.8
|
20.0
|
21.7
|
|
4
|
23.1
|
26.4
|
26.0
|
21.0
|
24.1
|
|
5
|
25.2
|
29.0
|
25.0
|
28.0
|
26.8
|
图3 1~5代菌活菌计数结果
表4 1~5代菌活菌计数方差分析表
|
变异来源
|
平方和
|
自由度
|
均方
|
F
|
|
处理间
|
266.59
|
4
|
38.04
|
1.67
|
|
误差
|
341.97
|
15
|
22.8
|
|
总变异
|
608.56
|
19
|
/
|
2.3 不同传代体积差异比较 从表5可以看出两种传代体积猪鼻支原体不同生长情况，“0.3mL菌液加入9.7mL培养基”这种体积构成的传代方式下，20组菌液浓度平均值为24.4×108CFU/mL，标准差5.7；“0.9mL菌液加入29.1mL培养基”这种体积构成的传代方式下，20组菌液浓度平均值为7.2×108CFU/mL，标准差2.1；用双样本异方差假设下t检验对这两组实验数据进行分析，两种传代方式下活菌浓度之间差异极显著。
表5不同传代体积猪鼻支原体活菌浓度
|
菌液体积（ml）
|
培养基体积（ml）
|
活菌浓度（108CFU/ml）
|
平均值±标准差
|
|
0.3
|
9.7
|
24.2
|
21.8
|
39.0
|
20.0
|
15.0
|
16.0
|
23.1
|
26.4
|
27.2
|
19.0
|
24.4±
5.7**
|
|
19.0
|
26.0
|
21.0
|
30.5
|
25.2
|
31.4
|
29.0
|
22.0
|
25.0
|
28.0
|
|
0.9
|
29.1
|
6.7
|
5.2
|
5.1
|
9.6
|
10.8
|
6.4
|
7.0
|
6.0
|
4.1
|
6.3
|
7.2±
2.1**
|
|
3.4
|
8.1
|
8.1
|
6.2
|
6.6
|
6.4
|
11.3
|
10.3
|
7.4
|
8.1
|
注：“**”表示差异极显著
3讨论与小结
3.1 传代比例
传代比例是微生物传代过程中一项重要的技术参数，刘轶秋等曾将3%作为支原体液体培养基质控菌猪鼻支原体的传代比例[6]，而在日常检验中，常用的比例是10%，通过比较，10%接种传代的菌，前期生长较快，而3%接种传代的菌后期生长较快，两种浓度传代的菌浓度最后趋于统一。以3%比例传代，猪鼻支原体初始数量相对较少，培养基体积相对较多，单位数量猪鼻支原体获得的营养也更加丰富，更利于生长。另外，猪鼻支原体在培养基中代谢产生的酸性物质使pH值下降，而支原体这类微生物对生长环境的酸碱度有严格要求，pH值低于7的环境则会造成其生长抑制或死亡[2]，在3%比例传代下，菌液pH值下降相对较慢，以这种比例传代，对猪鼻支原体的生长亦是一种保护，通过上述分析，建议将3%作为培养基日常检验中的传代比例。
3.2 菌种最佳收获时间
结合猪鼻支原体的生长曲线和pH值变化来看，猪鼻支原体传代后16h~48h内活菌浓度达（4.6~13.1）×108CFU/mL，在这个时间段内收获菌液均可，但考虑到猪鼻支原体对低pH值的敏感性，故应根据每次传代接种情况的不同，在保证菌种充分生长的前提下，在菌液明显变黄（pH值＜7）前收获。
3.3 菌种代次
按照《中国兽药典》二〇一〇年版规定支原体液体培养基质控菌猪鼻支原体传代不可超过5代[4]，故本次实验只对照1~5代菌。通过比较各代次菌在相同温度下，培养相同时间后的活菌浓度，判断出各代次菌之间生长差异。通过统计学方法分析，1~5代菌活菌浓度之间无显著差异，在培养基检验工作中，为使培养基质控菌均一、稳定、活性强，可将1~5代菌作为质控菌工作菌液。
3.4 传代体积
猪鼻支原体兼性厌氧，且一般需要5%~10%CO2生长环境[2]，在封闭的细胞培养瓶中，培养基和菌液混合体体积较小，氧气二氧化碳等气体体积相对较大，小体积培养相对于大体积培养，优势在于气体更多。从本次试验结果来看，同为3%传代比例下，“0.3mL菌液+9.7mL培养基”这种小体积的传代方式比“0.9mL菌液+29.1mL培养基”这种大体积的传代方式更利于猪鼻支原体生长，前者收获时菌液浓度约为后者菌液浓度3倍，差异极显著，说明在相对封闭的空间中，小体积培养模式更利于猪鼻支原体生长，建议在日常培养基检验中，将0.3mL菌液加入9.7mL培养基中来传代。
参考文献
[1] 陆承平.兽医微生物学[M].北京：中国农业出版社，2007.
[2] 吴移谋，叶元康.支原体学[M].北京：人民卫生出版社，2008
[3] The United States Phamacopeial Convention，Inc. USP36NF31,General Chapter 63, Mycoplasma Tests[S].Rockville,MD,Volume1,2013:67-71
[4] 中国兽药典委员会.中国人民共和国兽药典二〇一〇年版三部[S]
[5] 谢庄，贾青.兽医统计学[M].北京：高等教育出版社，2005
[6] 刘轶秋，丁家波，李蓓蓓，等.支原体检验用培养基质控菌株的生长曲线与世代时间测定[J].中国兽药杂志，2012,46（12）：13-15,18
